血浆EGFR/T790M基因突变检测标准流程

　　表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）已经成为晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的有效靶向治疗药物，能够显著降低疾病进展或死亡风险，改善患者生存质量。然而，几乎全部EGFR基因突变患者在接受EGFR-TKI治疗后均会发生耐药，约60%患者由于T790M突变导致耐药发生[1,2]。国内外权威指南均强调EGFR-TKI治疗耐药后应尽进行T790M突变检测[3,4,5]。近些年，以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展，通过血浆循环游离DNA（cell free DNA, cfDNA）检测EGFR等基因突变具有显著优势，尤其适用于肿瘤标本不可评估（较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织）的患者，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等。T790M血液检测与组织检测可相互补充验证，避免假阴性结果，提高检出率，使患者获益。在实际血液检测操作过程中，各步骤的规范化处理与否对检测质量影响巨大。为提高EGFR/T790M血液检测质量，特制订本血浆EGFR/T790M 基因突变检测标准流程，以供参考使用。

　　血液采集→血浆分离与质控→血浆运输与储存→ctDNA 提取、定量、储存→EGFR 突变检测→检测报告

1.采血管

采血管常见有两类：

（1）cfDNA专用常温采血管：特指Streck Cell-Free DNA BCT® Blood Collection Tubes (10ml) ， 后文中用Streck cfDNA常温采血管或Streck管指代。

（2）EDTA管

禁用肝素抗凝管：由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除，肝素也会导致PCR效率降低，因此cfDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。

2. 使用Streck cfDNA常温采血管采集、储存、运输血液

（1） 血液采集操作流程：

　　1). 依据 CLSI H3-A6 指南或当地指南采集静脉血

 防止回流: 由于Streck 管含有化学添加物，必须避免血液回流。为防止回流，应采取以下措施：

　　a. 在采血过程中保持患者胳膊处于下方

　　b. 保持采血管和管塞处于上方，防止采血管管内容物触及管塞或针的末端

　　c. 在血液开始流入采血管时立即或在两分钟内释放止血带

　　2). 遵循 CLSI H3-A6 或当地指南或实验室准则采血

　　3). 采集10ml血液，完全填满采血管

　　4). 从适配器上取下采血管，握住采血管，立即轻柔颠倒10次。颠倒不充分或颠倒不及时均可能导致提取结果欠佳。一次完整颠倒包含手腕完全旋转180度再折回，如下图所示：

图 1采血管颠倒混匀

（2）血液储存及运输

为保证后续血浆分离及cfDNA提取质量，Streck管禁止冷藏/冷冻血液标本，建议常温保存及运输(6-36℃)至指定实验室。从采血至运输到实验室检测的时间间隔不超过3天。

3. 使用EDTA管(10ml) 采集、储存、运输血液

（1）遵循标准静脉采血程序采集10ml血液, 轻柔颠倒6-8次以混匀标本，切勿摇晃.

（2）禁止冷冻血液标本，建议4℃保存。

（3）血液应尽快离心处理，1小时内处理最佳，至多不超过2小时。本操作流程包括两步离心，以防止最终样本中出现基因组DNA/RNA污染。

4. 采血量的要求

（1）不同平台对血浆量的要求量不一样，一般要求采用 10mL 采血管，10ml 血液大约能分离出 4-5ml 血浆。

（2）对同一患者，血浆量越多，所提取的DNA量就越多，其中含有的 cfDNA量也就越高，对检测越有利

图 2对同一患者，血浆量越多，所提取的DNA量就越多，其中含有的 cfDNA量也就越高(Sherwood et al. 2016 PLoSONE)

5. 血液采集后送到实验室检测所能允许的最大时间间隔

（1）两小时内处理标本能最大程度避免血细胞破裂而造成基因组DNA (gDNA) 污染

图 3  A. 2h 内处理标本，不论采用 EDTA管还是 cfDNA BCT 管，DNA浓度均无显著差异; B. 72h 内处理标本，不论 EDTA管还是 cfDNA BCT 管，DNA 浓度较 2h 时均显著提高，即 gDNA 污染增加(Sherwood et al. 2016 PLoSONE)

（2）不能在两小时内处理标本时，cfDNA BCT(Streck)管 优于 EDTA 管

图 4 左图，2h 内处理标本，EDTA管和 cfDNA BCT 管无显著差异; 右图，72h内处理标本时，EDTA 管DNA浓度显著高于cfDNA BCT 管，即 EDTA 管中 gDNA 污染显著高于 cfDNA BCT 管(Sherwood et al 2016 PLoSONE)

（3）不同采血管所能允许的最大时间间隔

　　1）Streck 管：从采血至运输到实验室检测的时间间隔不超过3天。

　　2）EDTA 管：强烈建议在医院离心，分离出血浆之后干冰运输至实验室。从采血至分离血浆至多不能超过2小时。

6. 血液采集后送往实验室检测前的保存方式和条件

（1）Streck 管：血液应该在室温（6℃-36℃）储存，在室温（6℃-36℃）环境下运输至实验室。

（2）EDTA 管：从采血至运输到中心实验室离心处理至多不能超过2h，离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏。分离血浆后，应立即竖直放置，冷冻血浆，-80℃冷冻最佳（或-20℃冷冻直至干冰运输）。

1.血浆分离-Streck cfDNA常温采血管

Steck管血液应室温储存，在室温环境下（6-36℃）运输至指定实验室，实验室应在标本到达当日处理血液

（1）离心Streck 管：1600 ×g，10min，室温（使用水平转子）

（2）吸出血浆层（约4-5ml血浆），注意不要触及淡黄色薄层（在枪尖和淡黄色薄层之间留出5mm空隙），转入4个 1.5-2ml 离心管。

图 5 抽取上清

（3）离心：1600×g, 4℃, 10min

（4）吸出血浆层，切勿触及残渣，转入5 个小离心管中，每管转入1ml。

（5）立即竖直放置，冷冻血浆，-80℃冷冻最佳（或-20℃冷冻直至干冰运输）。

（6）使用试剂盒抽提cfDNA之前，建议再一次离心：16000×g，4℃（使用角转子）。用于去除残留的细胞碎片。

2.血浆分离-EDTA管

使用EDTA管血液应按照如下程序尽快处理，1小时内处理最佳，至多不超过2小时。本操作流程包括两步离心，以防止最终样本中出现基因组DNA/RNA污染。

（1）离心：2000×g，4℃，10min

注意：请确保离心机的减速装置处于OFF状态，以避免（在离心后因减速过快而）破坏淡黄色薄层。

（2）吸出血浆层（约4-5ml血浆），注意不要触及淡黄色薄层（在枪尖和淡黄色薄层之间留出5mm空隙），转入15ml离心管

（3）离心：2000×g，4℃, 10min

（4）吸出血浆层，切勿触及下方非血浆层，转入5 个小离心管中，每个转入1ml

（5）立即竖直放置，冷冻血浆，-80℃冷冻最佳（或-20℃冷冻直至干冰运输）

（6）使用试剂盒抽提cfDNA之前，建议再一次离心：16000×g，4℃（使用角转子）。用于去除残留的细胞碎片。

3. 采样质量评价

（1）离心后溶血：

严重溶血下，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。

图 5  4号、5 号样本属于溶血样本，需要重新采血

（2）血脂过高，使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对Real Time PCR有干扰。

图 6 重度的图示为脂血+溶血现象

（3）血浆中胆红素含量过高，肉眼观看显黄色，胆红素可抑制Taq酶活性。

除严重溶血情况外，其他情况视DNA 提取结果确定是否可进入后续检测

4.实验废弃物处理

　　到保存期后，标本、容器以及检验过程中接触标本的材料应按《医疗废物管理条例》（国务院令第380号）、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》（中华人民共和国卫生部令(第36号)）、《全国临床检验操作规程》（中华人民共和国卫生部医政司，第四版）的相关规定处理。

1. cfDNA提取

常用的 cfDNA 提取试剂盒包括以下几种：

（1）QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)，具体操作步骤见产品说明书（货号：55114）。

（2）MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific)，具体操作步骤见产品说明书（货号：A29319）。

（3）Cobas® DNA Sample Preparation Kit（Roche, 适用Cobas® EGFR突变检测试剂盒）

2. cfDNA 定量（可选）

（1）提取 DNA 经过充分混匀之后（涡旋振荡）再进行定量

（2）常用的定量仪器方法包括以下两种：

　　1)Qubit® 3.0(Thermo Fisher)，操作方便，结果良好，临床采用较多

　　2)荧光定量或定量 RT-PCR 法，相比于用分光光度计法定量，敏感性和准确性较高。定量 PCR 可选试剂盒包含ABI TaqMan® RNase P Detection Reagents Kit 和 TaqMan® Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)。RNase P 检测复制子大小为 87bp时，适宜检测 cfDNA。

3. cfDNA 储存

　　cfDNA提取后应立即进行后续检测。若由于条件限制，不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA, 首选-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱，可选择-20℃保存。应尽可能缩短冻存时间，尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整，避免反复冻融。

　　EGFR/T790M血液样本突变检测主要通过扩增阻碍突变系统(ARMS)、数字PCR（digital PCR）系统以及NGS（Next generation sequencing）系统等三大平台进行。ARMS属于半定量检测方法，是目前临床应用最广泛的EGFR检测方法。用于T790M血浆检测的ARMS方法主要包含cobas® EGFR Mutation Test v2及厦门艾德生物医药科技股份有限公司开发的super-ARMS检测。Super-ARMS检测灵敏度可达0.2~0.5%，报告周期约为3~4天。数字PCR是目前颇受关注的一类新技术平台。国外临床转化研究显示其是一种高度灵敏能够绝对定量的血浆EGFR/T790M突变检测方法[6-11]，其检测灵敏度可达0.1%以下，主要平台包含Bio-RAD公司生产的QX200 ddPCR、ThermoFisher公司生产的QuantStudio 3D PCR以及Sysmex Inostics公司生产的BEAMING PCR。国内基于数字PCR平台的相关EGFR/T790M临床检测试剂盒正在开发中。二代测序NGS平台是检测多基因多突变位点的高通量理想方法，除检测已知突变位点外，还可以检测未知突变位点。但其操作流程较为复杂，数据分析解读对人员要求较高，报告周期多在2~3周左右，相关临床应用质控及规范尚在完善当中。

图 6 数字PCR 流程图。主要包括样本准备，分布，PCR反应和数据输出

　　EGFR/T790M基因突变检测报告可参考非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识中所要求的内容[12]，应包含患者及标本基本信息、DNA质量、检测方法、检测仪器、检测结果(建议包括明确的病理诊断及专业书写)及结果解读诠释、相关临床意义及检测过程中出现的状况及不确定结果和因素，以供临床医师全面参考。从接收标本到出具报告的周期建议不超过3个工作日，以满足临床需求。检测报告模板参见附件一。